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Wir getränkten Thermolysin und DRAK2 Kristalle für Minuten bis Stunden auf Roadrunner I Chips. Wir verwendeten 200 mM Natriumaspartat (in 0,1 M MES-NaOH pH 6,5, 10 mM CaCl2, 25% PEG 2000, 25% Ethylenglykol) und 50 mM ATP (in 0,2 M Ammoniumacetat, 20% PEG 3350, 50 mM Natrium/Kaliumtartrat, 25% Ethylenglykol) für Thermolysin bzw. DRAK2. DRAK2 ist eine Serin-/Threoninkinase, die an Autoimmunerkrankungen und Krebs beteiligt ist (Sanjo et al., 1998; Doherty et al., 2009; Yang et al., 2012; Edwards et al., 2015; Harris & McGargill, 2015). DRAK2-Kristallen wurden durch Batch-Kristallisation angebaut und auf einem Roadrunner I Chip für 1 h mit dem natürlichen Liganden ATP mit der On-Chip-Kristallisationskammer eingeweicht. Die Clusteranalyse der gesammelten Daten mit BLEND führte zu einem 2,5-A-Auflösungsdatensatz, der aus vier einzelkundätseigenen Kristallen zusammengeführt wurde. Die Kristallstruktur wurde durch molekularen Ersatz mit der Quercetin-gebundenen Struktur von DRAK2 (PDB-Eintrag 3lm5) als Suchmodell gelöst. An der aktiven Stelle ist die Elektronendichte für das Nukleotid und ein koordiniertes Magnesiumion deutlich sichtbar, obwohl die fehlende Dichte für das Phosphat darauf hindeutet, dass ATP während der Inkubation auf ADP hydrolysiert wurde [Abb. 11(b)]. Eine ausführlichere Beschreibung der aktiven Seite und ein Vergleich mit Strukturen der zugehörigen Kinase DAPK1 finden Sie in den unterstützenden Informationen. Diese kostenlose Onlineversion von Office enthält alles, was Sie von Office erwarten, sowie Microsoft Teams. In allen Fällen wurden Proteinlösungen mit Niederschlagslösungen im Verhältnis 1:1 gemischt.

Die für den Tropfen und das Reservoir verwendeten Volumina betrugen 6 bzw. 500 l für die Hängetropfenexperimente und 100 l bzw. 5–7 ml für die On-Chip-Kristallisationsexperimente. Sofern nicht anders angegeben, wurden Kristallisationsexperimente bei Raumtemperatur durchgeführt. Für Machbarkeitsstudien wurden die beiden Proteine Proteinase K und Thermolysin auf Roadrunner I-Chips kristallisiert. Proteinase-K-Kristallen mit den Abmessungen von 20–30 m wurden durch Mischen von 15 mg ml-1-Proteinase K (Tritirachium-Album, Carl Roth) in 0,1 M CHC-Puffer pH 7,0, 10 mM CaCl2 im 1:1-Verhältnis mit Ausscheidungslösung (0,1 M CHC-Puffer pH 6,5, 0,6 M Ammoniumsulfat, 10 mM CaCl2) angebaut. 3 l dieses Gemischs wurde auf einen Roadrunner I-Chip aufgetragen und 500 l Niederschlagslösung als Reservoir verwendet. Kristalle erschienen in der Regel innerhalb von 12–14 h bei Raumtemperatur.

Für die On-Chip-Kristallisation von Thermolysin (Geobacillus stearothermophilus, Sigma) wurde das Protein in 50 mM NaOH bis zu einer Endkonzentration von 20 mg ml 1 gelöst und im Verhältnis 1:1 mit Ausscheidungslösung (0,1 M MES-NaOH pH 6,5, 10 mM CaCl2, 25% PEG 2000) gemischt. 3 l dieses Gemischs wurden auf einen Roadrunner I-Chip aufgetragen und gegen eine 500-l-Gefälltmiritantlösung ausgebracht, um nach 1–2 Tagen Inkubation bei Raumtemperatur Kristalle von 35 x 140 m Größe zu erhalten. Das Kristallwachstum wurde mit einem Olympus SZX16 Mikroskop sowie einer zugehörigen Kamera und der Olympus cellSens Standard Software für Kristallgrößenmessungen überwacht. Wählen Sie aus einer Reihe von robusten, verschüttungssicheren und fleißigen Laptops und 2-in-1-Laptops mit kostenlosem Online-Training und Support. Das effiziente Verladen von vorgewachsenen Proteinkristallen auf festgerichtete Probenhalter ist nach wie vor eine Herausforderung, da dies zusätzliche Kristallhandhabungsschritte mit sich bringt und oft zu Kristallclustern führt, wenn die umgebende Flüssigkeit entfernt wird (Soares et al., 2014).

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